摘要：為了解四川省兔出血癥病毒2型（rabbit hemorrhagic disease virus type 2,，RHDV2）的流行情況及分子遺傳變異特征，采集全省范圍內(nèi)的7 525份樣品,，其中發(fā)病兔場肝臟組織樣品117份,、環(huán)境拭子樣品243份,，受監(jiān)測兔場血液樣品3 340份、環(huán)境拭子樣品3 825份,，采用商品化熒光RT-PCR試劑盒,，對以上樣品進行RHDV2檢測；對篩選出的12份肝組織陽性樣品進行RHDV2 VP60基因RT-PCR擴增,、測序和遺傳進化分析,。結(jié)果顯示：RHDV2流行無明顯季節(jié)性，各養(yǎng)殖品系家兔均有RHDV2感染,，哺乳仔兔,、幼兔、懷孕哺乳母兔死亡率分別為25%~60%,、18%~45%,、9%~30%。發(fā)病兔場肝臟樣品RHDV2陽性檢出率為88.89%（104/117）,，環(huán)境樣品為46.09%（112/243）,；受監(jiān)測兔場全血樣品RHDV2陽性檢出率為25.99%（868/3340），環(huán)境樣品為16.29%（623/3825）,。12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因序列長度均為1 740 bp,，核苷酸序列同源性為98.4%~100%，在系統(tǒng)發(fā)生進化樹上獨成一簇,；與國內(nèi)外參照毒株的VP60基因序列核苷酸同源性為93.7%~100%,，編碼的氨基酸序列同源性為95.7%~99.8%。結(jié)果表明：RHDV2已開始在四川省流行,，需要加強檢疫,，重視飼養(yǎng)管理工作；其VP60基因序列出現(xiàn)了一定程度的變異，但遺傳演化相對穩(wěn)定,。本研究補充了國內(nèi)RHDV2的分子流行病學信息,，也為該病的相關(guān)防控研究和控制對策制定提供了參考。

兔病毒性出血癥（rabbit hemorrhagic disease,，RHD）俗稱兔瘟,，是兔的一種急性、高度致死性傳染病,。RHD因潛伏期短,、發(fā)病急、病程短,、傳播快,、死亡率高（可達100%），被我國列為二類動物疫病,。該病典型病變特征是呼吸系統(tǒng)出血,，實質(zhì)器官淤血、腫大,、出血,，肝臟壞死，由嵌杯病毒科（Caliciviridae）兔病毒屬（Lagovirus）兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus,，RHDV）感染引起,。根據(jù)感染的RHDV基因型不同（RHDV GI.1~4），RHD可分為RHD1型（經(jīng)典型）和RHD2型兩種,。其中,，RHD1型曾在世界很多國家發(fā)生和流行，但隨著免疫接種等防控措施的實施,，RHD1的流行得到基本控制,。RHD2型由RHDV GI.2基因型毒株（以下稱RHDV2）感染引起，2010年由法國首次報道,。2020年以前,，RHD2主要在歐洲一些國家發(fā)生，之后出現(xiàn)在非洲國家以及美洲的美國和墨西哥,，呈現(xiàn)蔓延趨勢,。2020年4月我國四川省金堂縣首次發(fā)生RHD2疫情，平均死亡率為42.85%,，共撲殺銷毀家兔3 500余只,，給養(yǎng)殖戶帶來較大經(jīng)濟損失。國內(nèi)目前沒有預防RHD2的疫苗,，也無有效的治療藥物可用,，因而該病嚴重威脅著養(yǎng)兔業(yè)健康發(fā)展。

為了解四川省RHDV2的流行情況、分子流行病學特征和遺傳變異規(guī)律,，本研究于2020—2021年對四川省兔場進行了流行病學調(diào)查,，采用熒光RT-PCR方法，對發(fā)病兔場的360份樣品（117份病死兔肝臟組織樣品,、243份兔場環(huán)境拭子樣品）和705個受監(jiān)測兔場的7 165份樣品（3 340份全血樣品及3 825份環(huán)境拭子樣品）進行了RHDV2核酸檢測,，篩選出12份來自不同地區(qū)發(fā)病兔場的病原核酸陽性樣品；設(shè)計合成2對RHDV2 VP60基因特異性引物,，通過常規(guī)分子生物學技術(shù),，對12份RHDV2核酸陽性樣品進行了VP60基因擴增測序和遺傳變異分析，以期為有效控制RHD2型疫情在四川省的蔓延及其控制對策制定提供參考,。

毒株,、菌種及試劑

2×Taq PCR Master mix、瓊脂粉和TIANgel Midi Purification Kit（DP209）等,，購自成都安雅生物試劑有限公司；DL 2 000 DNA Marker,，購自成都大連寶生物科技有限公司,；病毒DNA/RNA提取試劑盒（4.0），購自西安天隆科技有限公司,；RHD2型熒光RT-PCR檢測試劑盒,，購自四川博策檢測技術(shù)有限公司；EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預混液試劑盒,，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司,。

樣品來源

受檢樣品共計7 525份。其中：360份來自發(fā)病兔場,，包括117份病死兔肝臟組織樣品和243份發(fā)病兔場環(huán)境拭子樣品,，采自12個地市18個縣區(qū)25個發(fā)病兔場（表1）；7 165份血液及環(huán)境拭子樣品,，采自受監(jiān)測的705個規(guī)模兔場,，包括2020年在全省所有地市432個集中監(jiān)測規(guī)模兔場采集的全血樣品2 080份、兔場環(huán)境樣品2 345份,，2021年在全省12個地市273個集中監(jiān)測規(guī)模兔場采集的全血樣品1 260份,、兔場環(huán)境樣品1 480份。

樣品采集

肝臟組織樣品：對病死兔解剖,，無菌采集肝臟組織,，-20 ℃凍存?zhèn)溆茫画h(huán)境棉拭子：采集兔養(yǎng)殖場地面,、圈舍,、食槽、排泄物等環(huán)境樣品，置于PBS緩沖液中,，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。受監(jiān)測兔場采樣原則：存欄500只及以上的規(guī)模兔場，每個兔場至少采集10份全血樣品和10份環(huán)境樣品,；500只以下的兔場,，采集5份全血樣品和5份環(huán)境樣品。以上樣品均由四川省動物疫病預防控制中心收集保存,。 

發(fā)病兔場流行病學調(diào)查

統(tǒng)計發(fā)病兔場發(fā)病時間,、地點、家兔品系,、存欄量,、死亡率等基本信息，分析RHD2的發(fā)生與季節(jié),、品系等的相關(guān)性,，統(tǒng)計不同生長階段兔只的死亡率。

熒光RT-PCR檢測

將肝臟組織樣品研磨勻漿,，離心取上清,，將環(huán)境拭子樣品離心取上清，將全血樣品直接取樣,，按常規(guī)方法進行總RNA提取,，使用RHD2型熒光RT-PCR檢測試劑盒進行檢測。

VP60基因擴增及測序

根據(jù)GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中的RHDV2基因組序列,，通過DNAstar和Premier 5.0軟件分析后,，針對VP60基因片段設(shè)計2對特異性引物（表1）。引物由成都擎科生物有限公司合成,，按照合成說明書將其稀釋至10 μmol/L,，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/span>

將經(jīng)熒光RT-PCR檢測篩選出的12份來自不同地區(qū)發(fā)病兔場的RHDV2核酸陽性肝組織樣品，提取總RNA,，根據(jù)EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預混液試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄操作,，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）為模板，分別以P1/P2,、P3/P4為引物,，進行RHDV2 VP60兩段基因的PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,。純化回收PCR產(chǎn)物,，由成都擎科生物有限公司進行序列測定，用DNAstar軟件拼接后進行測序結(jié)果的Blast分析,。

VP60基因序列分析

使用DNAstar等軟件分析擴增測序的RHDV2 VP60基因序列的結(jié)構(gòu)組成特征,，收集GenBank中的國內(nèi)外14條不同基因型的RHDV VP60基因序列和10條RHDV2 VP60序列進行RHDV2 VP60基因的核苷酸及其編碼氨基酸的同源性分析,，同時繪制VP60基因序列系統(tǒng)進化樹進行遺傳變異分析。

發(fā)病兔場流行病學調(diào)查

經(jīng)過對發(fā)病兔場的流行病學調(diào)查可知：RHD2流行無明顯季節(jié)性,；伊拉配套系,、新西蘭兔、伊普呂配套系,、伊高樂配套系等多個品系家兔均有發(fā)?。徊溉樽型盟劳雎蕿?5%~60%,，部分呈現(xiàn)整窩死亡,，幼兔死亡率為18%~45%，懷孕哺乳母兔死亡率為9%~30%,。具體情況見表2,。

熒光PCR檢測

發(fā)病兔場　2020—2021年，累計檢測發(fā)病兔場117份肝臟組織樣品及243份環(huán)境樣品,，檢出肝臟組織陽性樣品104份,，陽性檢出率為88.89%，檢出兔場環(huán)境陽性樣品112份,，陽性檢出率為46.09%,。部分RHDV2熒光RT-PCR檢測結(jié)果見圖1。

受監(jiān)測兔場　2020年共檢測全血樣品2 080份,，陽性檢出率為14.18%,，檢測環(huán)境樣品2 345份,，陽性檢出率為10.28%,；涉及規(guī)模場432個，場點陽性檢出率為8.56%,，2021年共檢測全血樣品1 260份,，陽性檢出率為45.48%，檢測環(huán)境樣品1 480份,，陽性檢出率25.81%,；涉及規(guī)模場273個，場點陽性檢出率為39.93%,。全血樣品總體陽性檢出率為25.99%（868/3 340）,，環(huán)境樣品總陽性檢出率為16.29%（623/3 825）。具體統(tǒng)計結(jié)果見表3,。

VP60基因RT-PCR檢測

分別以P1/P2,、P3/P4為引物，對抽提的12份RHDV2陽性病料中的VP60基因不同片段進行RT-PCR擴增,，結(jié)果如圖2-A和圖2-B所示,。每份RHDV2都擴增出約1 095 bp和1 117 bp預期大小的兩條特異性DNA條帶（即VP60a和VP60b片段）,，陰性對照樣品無擴增。

VP60基因測序鑒定

分別對12份RHDV2陽性樣品的VP60基因不同片段進行純化回收及序列測定,，將測序結(jié)果拼接后進行Blast分析,。結(jié)果顯示，12條擴增序列與GenBank中RHDV2毒株的同源性均在97%以上,，表明成功擴增出了12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因序列,。通過DNAstar軟件進行VP60編碼框（ORF）序列整理，分別編號為SCh202001—SCh202012,。 

VP60基因序列特征

采用DNAstar生物學信息軟件MegAlign程序進行12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因序列特征分析,，結(jié)果受檢的12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因序列長均為1 740 bp，編碼579個氨基酸,。12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因序列在第18,、24、99,、105,、114、132,、213,、252、321,、330,、363、378,、399,、568、612,、705,、723、741,、765,、804、828,、882,、885、930,、1 026,、1 056、1 089,、1 095,、1 155,、1 156、1 165,、1 227,、1 231、1 242,、1 284,、1 317、1 551,、1 576,、1 608、1 618和1 622 bp共41處核苷酸存在突變,，核苷酸序列同源性為98.4%~100%,，其中114、1 156,、1 165,、1 231、1 576,、1 618和1 622 bp 等7處為錯義突變,，其他34處均為同義突變，且SCh202004和SCh202005,、SCh202007和SCh202009同源性為100%,，表明12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因遺傳相對穩(wěn)定。

VP60基因同源性分析

通過DNAstar軟件與GenBank中的10條RHDV2毒株VP60參考序列（表2）進行同源性分析,，發(fā)現(xiàn)22條VP60基因序列核苷酸同源性為93.7%~100%,，其中Sch202010與2020年新加坡RHDV2分離株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）同源性最低（93.7%）；推導的對應(yīng)氨基酸序列同源性為95.7%~99.8%,，其中SCh202002,、SCh202003,、SCh202004,、SCh202005和SCh202006與2010年法國RHDV2分離株10-32（HE800532）同源性最低（95.7%），而Sch202010與2020年新加坡RHDV2 分離株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）推導氨基酸同源性最低（97.2%）,。結(jié)果表明,，12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因與國外早期和最近毒株相比出現(xiàn)了一定程度變異，但仍相對穩(wěn)定,。

VP60基因遺傳演化分析

通過DNAstar軟件對12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因序列與國內(nèi)外14條不同基因型的RHDV VP60序列和10條RHDV2 VP60序列進行核苷酸比較,，繪制系統(tǒng)發(fā)生進化樹（圖3）。經(jīng)典型RHD毒株（GI.1毒株）和RHDV2毒株形成兩個大分支：參考的經(jīng)典型RHD毒株又分為2個分支,，國內(nèi)的經(jīng)典型RHD株分別處在不同分支,；RHDV2毒株也可分為2個分支,，12份陽性樣品的RHDV2 VP60序列和我國2020年RHDV2 SC2020-04株（MT383749）單獨成簇，與Sweden 2018年分離株2381（MH341513）在一個分支,，與新加坡RHDV2分離株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）處于不同分支,。結(jié)果表明，RHDV2毒株VP60基因序列遺傳演化可能會呈現(xiàn)復雜化趨勢,，目前仍相對穩(wěn)定,。

2010年法國報道出現(xiàn)RHD2后，意大利,、西班牙,、德國、葡萄牙,、英國,、挪威等多數(shù)西歐國家和亞速爾群島，以及北非和南非一些國家陸續(xù)報道了該病的發(fā)生,，2019—2020年美國,、墨西哥、日本,、中國和菲律賓報道發(fā)生該亞型疫情,，RHD2疫情流行速度快，暴發(fā)范圍廣,，呈現(xiàn)出替代經(jīng)典型RHD（RHD1）趨勢,。

本研究通過流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，RHD2流行無明顯季節(jié)性,，常見的品系家兔均有發(fā)病,，其中伊拉配套系發(fā)病死亡率較高，乳兔和幼兔死亡率高于成兔,，這與國外相關(guān)報道一致,。樣品檢測結(jié)果顯示，發(fā)病兔場和受監(jiān)測兔場的環(huán)境樣品陽性率在16.29%以上,，提示RHDV2傳播潛力強大,，加強飼養(yǎng)管理和做好消毒等的日常預防具有重要意義。

據(jù)相關(guān)報道,，我國首次發(fā)生RHD2疫情的兩個兔場的RHDV2 VP60基因片段核苷酸同源性為99.1%,，與RHDV2參考毒株的同源性為94.1%~98.3%，屬于同一分支上,，與經(jīng)典型RHD毒株的同源性為79.0%~80.0%,，親緣關(guān)系較遠。為進一步了解其分子流行特點,，本研究對12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因全序列進行了克隆分析,。作為RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,，VP60蛋白的氨基酸序列可分為A（1~21）、B（22~300）,、C（301~328）,、D（329~343）、E（344~434）和F（435~580）6個區(qū),，通過折疊成內(nèi)殼（S-shell區(qū)）和外殼（P2區(qū)）兩個主要的緊湊區(qū)域構(gòu)成衣殼,，其中N端的A和B區(qū)組成內(nèi)殼區(qū)，C端的C,、D,、E、F區(qū)組成外殼區(qū),，分別位于N端第3l~250位和C端第477~579位氨基酸之間的主要抗原區(qū)域,。本研究表明，受試的12份RHDV2 VP60基因核苷酸序列有41處突變,，含34處同義突變和7處錯義突變,，即VP60蛋白的B（22~300）1處、E（344~434）2處和F（435~580）3處錯義突變,。這一點與金明蘭等研究RHDVYL毒株VP60基因遺傳演變分析時得出的VP60蛋白A,、B、D,、F區(qū)變異相對較低,、C、E區(qū)變異較高的結(jié)論存在一定差異,，這需要在更多RHDV2 VP60序列的變異分析上進一步驗證,，當然這也可能是RHDV2毒株遺傳變異的特點。雖然目前12份RHDV2 VP60基因的遺傳演變相對穩(wěn)定,，但仍需要警惕較大變異幅度的毒株出現(xiàn),。

通過DNAstar軟件對12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因序列與國內(nèi)外14條不同基因型的RHDV VP60序列和10條RHDV2 VP60序列繪制系統(tǒng)發(fā)生進化樹，發(fā)現(xiàn)12份RHDV2 VP60序列和我國2020年RHDV2 SC2020-04株（MT383749）單獨成簇,，與Sweden 2018年分離株2381（MH341513）參考序列同源性較高,；RHDV2毒株VP60序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，RHDV2 VP60基因序列核苷酸同源性為93.7%~100%,，其中Sch202010與國外毒株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）同源性最低（93.7%）,，但是12份陽性樣品的RHDV2 VP60核苷酸序列同源性為98.4%~100%,，這都表明12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因與國外早期和最近毒株相比出現(xiàn)了一定程度變異,，但遺傳相對穩(wěn)定，同時也提示目前我國RHDV2毒株VP60基因比較保守且可能存在區(qū)域性特點,。需要注意的是,，本研究克隆分析用的RHDV2毒株均為同一時期的毒株,，通過系統(tǒng)發(fā)生進化樹發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)RHDV毒株流行時期不同,，分支也不同,，提示RHDV2毒株在我國很可能隨著時間和地區(qū)的改變出現(xiàn)新的變異現(xiàn)象。

本研究對四川全省1年多時間的RHDV2流行情況進行調(diào)查和統(tǒng)計分析,，對RHDV2基因序列信息進行收集比對,，對12份RHDV2 VP60基因進行了克隆測序和遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)RHDV2已經(jīng)在四川省多個地市存在,，其VP60基因序列出現(xiàn)了一定程度的變異,，但遺傳演化相對穩(wěn)定，RHDV2毒株單獨成簇,。本研究補充了國內(nèi)RHDV2的分子流行病學信息,，也為RHD2相關(guān)防控研究和控制對策制定提供了參考。