近日,，美國(guó) J.Craig Venter Institute（克雷格·文特爾研究所）Sanjay Vashee 研究員成果以“A synthetic genomics-based African swine fever virus engineering platform（基于合成基因組學(xué)的非洲豬瘟病毒工程平臺(tái)）”為題在 Science Advances（Q1 IF:11.7） 發(fā)表。

非洲豬瘟（ASF）是家豬的一種致命性病毒性疾病，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)有著巨大的經(jīng)濟(jì)影響,。它存在于非洲,、歐洲,、亞洲以及加勒比海的伊斯帕尼奧拉島,。目前沒(méi)有有效的治療方法，也沒(méi)有廣泛獲批許可的疫苗來(lái)預(yù)防這種疾病,。由于缺乏方便的工具來(lái)對(duì)其病原體非洲豬瘟病毒（ASFV）進(jìn)行基因改造,，抗擊非洲豬瘟的努力受到了阻礙，這在很大程度上是因?yàn)槠潺嫶蟮姆歉腥拘曰蚪M,。本研究中作者報(bào)告了利用合成基因組學(xué)方法,，借助一種由 CRISPR-Cas9 抑制的自輔助病毒，開(kāi)發(fā)出一種針對(duì)非洲豬瘟病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng),，以便從合成基因組中重建有活性的重組非洲豬瘟病毒,，從而快速產(chǎn)生各種非洲豬瘟病毒的組合突變體。該方法將極大地促進(jìn)針對(duì)非洲豬瘟的治療方法,、亞單位疫苗和減毒活疫苗的開(kāi)發(fā),。

作者基于之前的研究提出了一個(gè)假設(shè)：一種其復(fù)制能被某種機(jī)制（如宿主細(xì)胞中的 Cas9 切割）有效抑制的非洲豬瘟病毒株，應(yīng)該可以作為一種自輔助病毒,，用于包裝或 “啟動(dòng)” 對(duì)該抑制機(jī)制具有抗性的非洲豬瘟病毒株的病毒粒子 DNA,，從而實(shí)現(xiàn)病毒的重建。這個(gè)想法類(lèi)似于 20 世紀(jì) 60 年代和 70 年代初期使用條件致死的 “輔助” 噬菌體來(lái)轉(zhuǎn)染分離出的野生型 DNA 的方法,。

因此,，為了驗(yàn)證這一假設(shè),，作者選擇了兩株重組非洲豬瘟病毒株，ASFV-ArmeniaΔ285L::GFPhuCD4 和 ASFV-NHVΔTK::GFP,，這兩株病毒都表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）,，并且會(huì)因 p30 基因被 Cas9 切割而受到抑制,，將它們作為自輔助病毒,，同時(shí)選擇 ΔCD2v::DsRed 作為用于病毒重建的供體基因組。在將 ΔCD2v::DsRed 基因組轉(zhuǎn)染到正常的 WSL 細(xì)胞中,，隨后用 ASFV-ArmeniaΔ285L::GFPhuCD4 或 ASFV-NHVΔTK::GFP 感染后,，觀察到的主要是發(fā)綠色熒光的病灶，只有少數(shù)發(fā)紅色熒光或雙熒光的病灶,。

作者使用空斑大小和在 WSL 細(xì)胞上的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定對(duì)重建的 ΔCD2v::DsRed (D) 進(jìn)行了表征,。正如預(yù)期的那樣，它表現(xiàn)出與親本 ΔCD2v::DsRed (V) 相似的空斑大小,。此外,，ΔCD2v::DsRed (D) 的復(fù)制動(dòng)力學(xué)與親本 ΔCD2v::DsRed (V) 幾乎相同。這些結(jié)果驗(yàn)證了作者的假設(shè),，即自輔助病毒可用于從轉(zhuǎn)染的非感染性基因組中重建病毒,。

在成功開(kāi)發(fā)出用于病毒重建的自輔助病毒啟動(dòng)方法后，作者隨后建立了一個(gè)合成基因組學(xué)的基因組組裝過(guò)程來(lái)組裝非洲豬瘟病毒基因組,，這類(lèi)似于作者先前報(bào)道的用于人類(lèi)皰疹病毒的方法,。作者通過(guò)酵母中的轉(zhuǎn)化相關(guān)重組（TAR）技術(shù)，從 12 個(gè)重疊的野生型或修飾片段（或 “部分”）中組裝出了全長(zhǎng)的非洲豬瘟病毒 Kenya-IX-1033 “合成” 基因組,。

為了完善非洲豬瘟病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng),，作者試圖使用自輔助病毒（見(jiàn)上文）從組裝好的合成非洲豬瘟病毒基因組中重建活病毒。鑒于之前使用紅色熒光的非洲豬瘟病毒 CD2v 突變體基因組進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證,，作者組裝了一個(gè)類(lèi)似的全長(zhǎng)合成基因組,，其中整個(gè) CD2v 基因被 mCherry 替換（ΔCD2v::mCh）。

為了克服人工基因組末端帶來(lái)的問(wèn)題,，作者又嘗試使用同源的 Kenya-IX-1033 病毒本身作為輔助病毒,，從合成組裝的基因組中重建病毒，這將允許通過(guò)同源重組修復(fù)有缺陷的人工末端,。

在從合成組裝的基因組中成功重建出具有類(lèi)似野生型生長(zhǎng)特性的病毒后,，作者隨后試圖證明這種合成基因組學(xué)反向遺傳學(xué)系統(tǒng)在以組合式、全基因組方式對(duì)非洲豬瘟病毒進(jìn)行工程改造方面的實(shí)用性,。為此,，作者分別和組合地靶向 A238L、K145R 和 I329L 基因進(jìn)行缺失并獲得了這些活病毒,。此外,，作者還構(gòu)建了含有 mCherry 與 CD2v 的 C 端融合體（CD2v-mCh/p12M）或天藍(lán)色熒光蛋白（Cerulean）與 K145R 的融合體（K145R-Cer/p12M）重組病毒,，因它們可用于活細(xì)胞成像，輔助在感染過(guò)程中進(jìn)行功能表征,。

總之,，本研究報(bào)告了一種由創(chuàng)新的自輔助病毒方法介導(dǎo)的非洲豬瘟病毒合成基因組學(xué)反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)。非洲豬瘟病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)被用于生成組合式多基因缺失的 IX 型基因型毒株,，以及病毒基因產(chǎn)物與熒光蛋白融合的有活性毒株,，以促進(jìn)疫苗的開(kāi)發(fā)，或者更好地理解非洲豬瘟病毒的生物學(xué)特性和致病機(jī)制,。