根據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》,，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織制定了雞傳染性支氣管炎活疫苗非法添加/改變制苗用毒種檢測方法等4項(xiàng)檢測方法,，現(xiàn)予發(fā)布,，自發(fā)布之日起執(zhí)行,。

　　農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將加強(qiáng)對雞傳染性支氣管炎活疫苗等4種獸用疫苗產(chǎn)品監(jiān)督抽檢力度,，對發(fā)現(xiàn)的非法添加或改變制苗用毒種行為,，按照獸藥嚴(yán)重違法行為從重處罰情形嚴(yán)厲查處,。

　　

附件：

　　1.雞傳染性支氣管炎活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測方法

　　2.雞傳染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測方法

　　3.雞新城疫活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測方法

　　4.禽用滅活疫苗中非法添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原檢測方法
 

　　農(nóng)業(yè)農(nóng)村部

　　2023年10月23日

　　附件1：雞傳染性支氣管炎活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測方法

　　1.適用范圍

　　1.1本方法適用于雞傳染性支氣管炎活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種的檢測,。

　　1.2非法添加/改變制苗用毒種的檢測范圍為GI-1譜系(Mass-like),、GI-13譜系(4/91-like)、GI-19譜系(QX-like)和GI-

　　22譜系(LDT3-A-like)的雞傳染性支氣管炎病毒核酸,。

　　2.試驗(yàn)材料

　　2.1引物

　　針對雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)不同毒株基因序列差異區(qū),分別設(shè)計(jì)針對IBV的一對通用型引物和檢測GI-1譜系(Mass-like),、GI-13譜系(4/91-like),、GI-19譜系(QX-like)和GI-22譜系(LDT3A-like)的4對特異性引物，詳見表1,。

　　表1檢測IBV的通用型引物和不同譜系毒株的特異性引物

　

　2.2陽性對照和陰性對照

　　陽性對照:

　　GI-1譜系(Mass-like)代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(H120株),毒種編號為CVCC AV1514;

　　GI-13譜系(4/91-like)代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/49101株),毒種編號為CVCC AV1567;

　　GI-19譜系(QX-like)代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/QX01株),毒種編號為CVCC AV1568;

　　GI-22譜系(LDT3A-like)代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/ldt3a01株),毒種編號為CVCC AV1569,。

　　以上代表毒株均來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心。

　　陰性對照:生理鹽水或無菌水,。

　　2.3試劑

　　RNA提取試劑盒,、RT-PCR試劑、瓊脂糖,、50xTAE,、DNA marker、無核酸酶水,、生理鹽水,。

　　3.檢測方法

　　3.1樣品稀釋

　　取疫苗按瓶簽標(biāo)示，用生理鹽水稀釋至每毫升至少含250羽份,；陽性對照按瓶簽標(biāo)示原倍或10倍稀釋后使用,。

　　3.2RNA提取

　　將稀釋后的疫苗和陰、陽性對照按商品化核酸提取試劑盒進(jìn)行RNA核酸提取,。

　　3.3RT-PCR反應(yīng)

　　將3.2步驟提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作,按商品化的一步法RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),。RT-PCR反應(yīng)程序如下：第一階段,反轉(zhuǎn)錄50℃30min；第二階段,預(yù)變性92℃2min;第三階段,PCR擴(kuò)增94℃30s,，55℃30s,72℃1min,共30個(gè)循環(huán),，最后72℃延伸5min。RT-PCR反應(yīng)體系見表2:

　　3.4電泳

　　配制1%瓊脂糖凝膠,取10μL RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,，120V,，30min。

　　4.結(jié)果判定

　　4.1試驗(yàn)成立條件:陰性對照應(yīng)無條帶,各譜系代表毒株應(yīng)擴(kuò)增出相應(yīng)大小條帶,分別為:

　　雞傳染性支氣管炎病毒通用引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為266bp的條帶;

　　GI-1譜系(Mass-like)代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(H120株)應(yīng)擴(kuò)增出大小約為360bp的條帶;

　　GI-13譜系(4/91-like)代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/49101株)應(yīng)擴(kuò)增出大小約為328bp的條帶;

　　GI-19譜系(QX-like)代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/QX01株)應(yīng)擴(kuò)增出大小約為340bp的條帶;

　　GI-22譜系(LDT3A-like)代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/ldt3a01株)應(yīng)擴(kuò)增出大小約為787bp的條帶,。

　　4.2檢測樣品如不出現(xiàn)大小約為266bp的條帶,，則判定樣品中不含IBV核酸;檢測樣品如出現(xiàn)大小約為360bp的條帶，則判定樣品中檢出GI-1譜系(Mass-like)的IBV核酸;如出現(xiàn)大小約為328bp的條帶,，則判定樣品中檢出GI-13譜系(4/91-like)的IBV核酸;如出現(xiàn)大小約為340bp的條帶,，則判定樣品中檢出GI-19譜系(QX-like)的IBV核酸；如出現(xiàn)大小約為787bp的條帶,，則判定樣品中檢出GI-22譜系(LDT3A-like)的IBV核酸,。

　　附件2：雞傳染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測方法

　　1.適用范圍

　　1.1本方法適用于雞傳染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種的檢測。

　　1.2非法添加/改變制苗用毒種的檢測范圍為雞傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒株,、中等毒力及中等偏強(qiáng)毒力毒株,、弱毒力毒株、變異株的雞傳染性法氏囊病病毒核酸,。

　　2.試驗(yàn)材料

　　2.1引物

　　針對雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)不同毒力毒株基因序列差異區(qū),參考WOAH《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊》第3.3.12雞傳染性法氏囊病,設(shè)計(jì)VP2高變區(qū)的一對通用引物,。

　　Upper U3:5’-GCATGCGGTATGTGAGGCTTGGTGAC-3’,

　　Lower L3:5’-GAATTCGATCCTGTTGCCACTCTTTC-3’

　　2.2陽性對照

　　雞傳染性法氏囊病病毒陽性對照分別為：超強(qiáng)毒株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(SD1205E5株),，毒種編號為CVCC AV358，來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心,；

　　中等毒力及中等偏強(qiáng)毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(CF株),毒種編號為CVCC AV164，來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心,；

　　雞傳染性法氏囊病病毒(NF8株),，來源于乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠;弱毒力毒株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(B87株)，毒種編號為CVCC AV140,來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心,；

　　變異株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(LN2023株),，毒種編號為CVCC AV1570,來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心。

　　2.3試劑

　　RNA提取試劑盒,、RT-PCR試劑,、DNA片段回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶EagI-HF和StuI,、瓊脂糖,、50xTAE、DNA marker,、無核酸酶水,、生理鹽水。

　　3.檢測方法

　　3.1樣品稀釋

　　取疫苗按瓶簽標(biāo)示,用生理鹽水稀釋至每毫升至少含10羽份,。

　　陽性對照病毒含量至少應(yīng)為100ELD50/0.1ml,。

　　陰性對照:生理鹽水或無菌水。

　　3.2RNA提取

　　將稀釋后的疫苗和陰,、陽性對照按商品化核酸提取試劑盒進(jìn)行RNA核酸提取,。

　　3.3RT-PCR反應(yīng)

　　將3.2步驟提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作。RT-PCR反應(yīng)程序如下：第一階段,，反轉(zhuǎn)錄,，用六聚體隨機(jī)引物作為反轉(zhuǎn)錄引物獲得cDNA，在0.2ml PCR管中加入:RNA 8μL,，random hexamers(50μg/μL)1μL,，10mM dNTP mix 1μL，沸水浴5min,，冰浴2min,；再加入10μL cDNA合成預(yù)混液，反應(yīng)體系見表1,。

　　表1 cDNA合成預(yù)混液成分(10μL)
　　

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:25℃10min,；50℃50min；85℃5min,。

　　第二階段,，95℃3min,；95℃40s,60℃30s，72℃40s,，30個(gè)循環(huán),；72℃延伸10min。反應(yīng)體系見表2:

　　表2 PCR反應(yīng)體系(50μL)

　　3.4PCR產(chǎn)物回收,、酶切利用片段回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收,最終用32μL無核酸酶水進(jìn)行洗脫,。將回收產(chǎn)物利用EagI-HF和StuI進(jìn)行酶切，酶切體系(50μL)：10x Cutsmart Buffer 5μL,，DNA 30μL,，EagI-HF1μL，StuI 1μL,，ddH2O 13μL,，混勻后37℃水浴4h。

　　3.5電泳

　　配置2%瓊脂糖凝膠,取10μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳,，130V,40min,。

　　4.結(jié)果判定

　　4.1試驗(yàn)成立條件,陰性對照應(yīng)無條帶,不同毒力代表毒株應(yīng)出現(xiàn)相應(yīng)大小條帶,分別為:

　　超強(qiáng)毒株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(SD1205E5株)、中等毒力及中等偏強(qiáng)毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(CF株)應(yīng)出現(xiàn)大小約為234bp,、233bp和89bp條帶,實(shí)際檢測中僅可見234bp左右的一個(gè)條帶,，原因?yàn)?33bp條帶和234bp條帶差異過小,會出現(xiàn)重疊。89bp條帶片段過小,，電泳不可見,。

　　弱毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(B87株)應(yīng)出現(xiàn)大小約為556bp條帶。

　　變異株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(LN2023株)和中等毒力及中等偏強(qiáng)毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(NF8株)應(yīng)出現(xiàn)大小約為322bp和234bp條帶,。

　　4.2檢測樣品如出現(xiàn)大小約為556bp的條帶,，則判定樣品中檢出B87株類似IBDV核酸；如出現(xiàn)大小約為234bp的條帶,，則判定樣品中檢出CF株類似或者SD1205E5株類似IBDV核酸,；如出現(xiàn)大小約為322bp和234bp的條帶，則判定樣品中檢出LN2023株類似株或者NF8株類似IBDV核酸,。

　　4.3如需明確具體的雞傳染性法氏囊病病毒種類,可將酶切片段回收后進(jìn)行測序和blast比對,。

　　附件3：雞新城疫活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測方法

　　1.適用范圍

　　1.1本方法適用于雞新城疫活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種的檢測。

　　1.2非法添加/改變制苗用毒種的檢測范圍為基因Ⅶ型新城疫病毒核酸,。

　　1.3檢測對象為雞新城疫活疫苗La Sota株,、Clone30株、F株,、HB1株,、N79株、CS2株、V4/HB92株,、ZM10株,、VG/GA株等疫苗株。

　　2.試驗(yàn)材料

　　2.1引物

　　針對雞新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)F基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對通用型引物,。

　　NDV-F(Universas型)-F:5’-ACAGGRTCAATCATAGT-3’

　　NDV-F(Universas型)-R:5’-CAGTAWGAGGTGTCAAG-3’

　　針對基因Ⅶ型新城疫病毒F基因差異序列,，設(shè)計(jì)一對基因Ⅶ型特異性引物。

　　NDV-F(Ⅶ型)-F:5’-AGTTTAATAATACGGCGCGA-3’

　　NDV-F(Ⅶ型)-R:5’-GCAATAACTGAGCCYYTAAG-3’

　　2.2陽性對照和陰性對照

　　陽性對照:

　　雞新城疫病毒La Sota株,，毒種編號為CVCC AV1615,，來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心。

　　基因Ⅶ型新城疫病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品,，編號為CVCC Z333,，來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心,。

　　陰性對照:生理鹽水或無菌水,。

　　2.3試劑

　　RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑,、瓊脂糖,、50xTAE、DNA

　　marker,、無核酸酶水,、生理鹽水。

　　3.檢測方法

　　3.1樣品稀釋

　　取疫苗按瓶簽標(biāo)示,用生理鹽水稀釋至每毫升至少含100羽份,；;陽性對照按瓶簽標(biāo)示原倍或10倍稀釋后使用,。

　　3.2RNA提取

　　將稀釋后的疫苗和陰、陽性對照按商品化核酸提取試劑盒進(jìn)行RNA核酸提取,。

　　3.3RT-PCR反應(yīng)

　　將3.2步驟提取的RNA進(jìn)行一步法RT-PCR反應(yīng),，一步法RT-PCR反應(yīng)程序如下:50°C 30min,92°C 2min、94°C 30s,、55°C 30s,、72°C 1min,共30個(gè)循環(huán),最后72°C延伸10min。一步法RT-PCR反應(yīng)體系見表1:

　　表1一步法RT-PCR反應(yīng)體系(25μL)

　3.4電泳

　　配置1%瓊脂糖凝膠,取10μl RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,，120V,，30min。

　　4.結(jié)果判定

　　4.1試驗(yàn)成立條件,新城疫病毒(La Sota株)通用型引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為842bp條帶,，基因Ⅶ型新城疫病毒特異性引物應(yīng)無條帶,；基因Ⅶ型新城疫病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品通用型引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為842bp條帶，基因Ⅶ型新城疫病毒特異性引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為609bp特異性條帶,；陰性對照均無條帶,，則試驗(yàn)成立。

　　4.2樣品用新城疫病毒通用型引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為842bp條帶。若用基因Ⅶ型新城疫病毒特異性引物擴(kuò)增出大小約為609bp條帶,，則判定樣品中檢出基因Ⅶ型新城疫病毒核酸,。

　　附件4

　　禽用滅活疫苗中非法添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原檢測方法

　　1.適用范圍

　　1.1本方法適用于禽用滅活疫苗中非法添加制苗用毒種的檢測。

　　1.2非法添加制苗用毒種的檢測范圍為禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原,。

　　2.試驗(yàn)材料

　　2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　SPF雞,，4~6周齡。

　　2.2試劑

　　禽腺病毒Ⅰ群瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原,，陰性對照為SPF雞血清,，陽性對照為禽腺病毒Ⅰ群瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)陽性血清，均來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,；瓊脂粉或瓊脂糖,、氯化鈉、PBS(0.01M,、pH7.2),。

　　3.檢測方法

　　3.1免疫

　　用4~6周齡SPF雞15只,其中10只雞按制品推薦的免疫途徑和劑量進(jìn)行免疫。首次免疫后14天,，按照相同途徑(不同部位)和劑量進(jìn)行第二次免疫,。另取5只作為不免疫對照組。第二次免疫后21日每只雞分別采血,，分離血清,，用禽腺病毒I群瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原進(jìn)行抗體效價(jià)測定。

　　3.2抗體效價(jià)測定

　　3.2.1瓊脂板制備

　　稱取優(yōu)質(zhì)瓊脂粉或瓊脂糖1g,、氯化鈉8g,加入PBS(0.01M,、pH7.2)溶液100ml中，置沸水中水浴加熱融化,，室溫冷卻至60~65℃后,，倒入無菌平皿內(nèi)(瓊脂厚度約為5mm)，冷凝后加蓋倒置平皿,，防止水分蒸發(fā),，隔日使用應(yīng)在2~8℃保存。

　　3.2.2打孔

　　用六角形打孔器在瓊脂上打孔,，孔徑3~4mm,，孔間間距3mm。

　　3.2.3封底

　　挑出孔中瓊脂后,將平皿底部至酒精燈上微微加熱,，使孔底瓊脂稍微融化封底,。

　　3.2.4加樣

　　中央孔滴加瓊擴(kuò)抗原50μl，第2,、4孔滴加陽性對照各50μl,，第6孔滴加陰性對照50μl,第1,、3、5孔滴加待檢血清,，每孔50μl,。

　　3.2.5反應(yīng)將瓊脂板放入濕盒中，置37℃溫箱內(nèi)2小時(shí)后倒置瓊脂板,，繼續(xù)作用至24小時(shí),，然后移至室溫再放置48~72小時(shí)，觀察沉淀線,。

　　3.2.6瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)抗體檢測結(jié)果判定

　　3.2.6.1試驗(yàn)成立條件,，抗原孔與陽性對照之間出現(xiàn)沉淀線，與陰性對照之間無沉淀線出現(xiàn),，抗體檢測試驗(yàn)成立,。

　　3.2.6.2當(dāng)待檢血清與抗原孔之間形成沉淀線，并與陽性對照的沉淀線末端吻合,，則待檢血清判為陽性,；當(dāng)待檢血清與抗原孔之間未形成沉淀線，但陽性對照的沉淀線末端向待檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎,則判為弱陽性,。弱陽性樣品應(yīng)重檢一次,，仍為弱陽性時(shí)可判為陽性,；當(dāng)待檢血清與抗原孔之間未形成沉淀線,，或陽性對照與抗原孔間的沉淀線末端向毗鄰的待檢血清孔直伸或向外側(cè)偏彎時(shí)，則判該待檢血清為陰性,。

　　4.結(jié)果判定

　　4.1試驗(yàn)成立條件,對照組雞AGP抗體應(yīng)全部為陰性,試驗(yàn)成立,。

　　4.2若待檢樣品免疫雞血清1份及以上出現(xiàn)AGP抗體陽性，則判定該疫苗中添加了禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原,；若待檢樣品免疫雞血清均未出現(xiàn)AGP抗體陽性,，則判定該疫苗中未添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原。

來源：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部,。