根據(jù)《獸藥管理條例》,，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織制定了雞傳染性支氣管炎活疫苗非法添加/改變制苗用毒種檢測方法等4項檢測方法,，現(xiàn)予發(fā)布,，自發(fā)布之日起執(zhí)行,。 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將加強對雞傳染性支氣管炎活疫苗等4種獸用疫苗產(chǎn)品監(jiān)督抽檢力度,，對發(fā)現(xiàn)的非法添加或改變制苗用毒種行為,，按照獸藥嚴重違法行為從重處罰情形嚴厲查處,。 1.雞傳染性支氣管炎活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測方法 2.雞傳染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測方法 3.雞新城疫活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測方法 4.禽用滅活疫苗中非法添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原檢測方法附件1：
雞傳染性支氣管炎活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測方法
1. 1 本方法適用于雞傳染性支氣管炎活疫苗中非法添加/ 改變制苗用毒種的檢測。1. 2 非法添加/ 改變制苗用毒種的檢測范圍為 GI- 1 譜系(Mass-like),、GI-13 譜系(4/91-like)、GI-19 譜系(QX-like)和 GI-22 譜系(LDT3-A-like)的雞傳染性支氣管炎病毒核酸,。針對雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus, IBV)不同毒株基因序列差異區(qū),分別設(shè)計針對 IBV 的一對通用型引物和檢測 GI-1 譜系(Mass-like),、GI-13 譜系(4/91-like)、GI-19 譜系(QX-like)和 GI-22 譜系(LDT3A-like)的 4 對特異性引物,，詳見表 1,。表 1 檢測 IBV 的通用型引物和不同譜系毒株的特異性引物
GI-1 譜系(Mass-like) 代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(H120 株),毒種編號為 CVCC AV1514;GI-13 譜系(4/91-like) 代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/ CK/49101 株),毒種編號為 CVCC AV1567;GI-19 譜系(QX-like) 代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/ CK/ QX01 株),毒種編號為 CVCC AV1568;GI-22 譜系(LDT3A-like)代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/ CK/ ldt3a01 株),毒種編號為 CVCC AV1569。以上代表毒株均來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心,。RNA 提 取 試 劑 盒、 RT - PCR 試 劑,、 瓊 脂 糖,、 50xTAE、 DNA marker,、無核酸酶水,、生理鹽水。取疫苗按瓶簽標示,，用生理鹽水稀釋至每毫升至少含 250 羽份,；陽性對照按瓶簽標示原倍或 10 倍稀釋后使用。將稀釋后的疫苗和陰,、陽性對照按商品化核酸提取試劑盒進行 RNA 核酸提取,。將 3. 2 步驟提取的 RNA 進行反轉(zhuǎn)錄操作,按商品化的一步法RT-PCR 試劑盒說明書進行 RT-PCR 反應(yīng)。RT-PCR 反應(yīng)程序如下：第一階段,反轉(zhuǎn)錄 50℃ 30min,；第二階段,預(yù)變性 92℃ 2min;第三階段,PCR 擴增 94℃ 30s,，55℃ 30s,72℃ 1min,共 30 個循環(huán)，最后 72℃延伸 5min,。RT-PCR 反應(yīng)體系見表 2:表 2 RT-PCR 反應(yīng)體系(50μL)
配制 1% 瓊 脂 糖 凝 膠, 取 10μL RT - PCR 產(chǎn) 物 進 行 電 泳,，120V,，30min。4. 1 試驗成立條件:陰性對照應(yīng)無條帶,各譜系代表毒株應(yīng)擴增出相應(yīng)大小條帶,分別為:雞傳染性支氣管炎病毒通用引物應(yīng)擴增出大小約為 266bp 的條帶;GI-1 譜系 ( Mass - like) 代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(H120 株)應(yīng)擴增出大小約為 360bp 的條帶;GI-13 譜系(4/91 -like) 代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/ CK/49101 株)應(yīng)擴增出大小約為 328bp 的條帶;GI-19 譜系(QX-like)代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/ QX01 株)應(yīng)擴增出大小約為 340bp 的條帶;GI-22 譜系(LDT3A-like) 代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/ CK/ ldt3a01 株)應(yīng)擴增出大小約為 787bp 的條帶,。4. 2 檢測樣品如不出現(xiàn)大小約為 266bp 的條帶,，則判定樣品中不含 IBV 核酸;檢測樣品如出現(xiàn)大小約為 360bp 的條帶，則判定樣品中檢出 GI-1 譜系(Mass-like) 的 IBV 核酸;如出現(xiàn)大小約為328bp 的條帶,，則判定樣品中檢出 GI-13 譜系(4/91-like) 的 IBV核酸;如出現(xiàn)大小約為 340bp 的條帶,，則判定樣品中檢出 GI-19 譜系(QX-like)的 IBV 核酸；如出現(xiàn)大小約為 787bp 的條帶,，則判定樣品中檢出 GI-22 譜系(LDT3A-like)的 IBV 核酸,。
附件2：
雞傳染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測方法
1. 1 本方法適用于雞傳染性法氏囊病活疫苗中非法添加/ 改變制苗用毒種的檢測。1. 2 非法添加/ 改變制苗用毒種的檢測范圍為雞傳染性法氏囊病病毒超強毒株,、中等毒力及中等偏強毒力毒株,、弱毒力毒株、變異株的雞傳染性法氏囊病病毒核酸,。針對雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)不同毒力毒株基因序列差異區(qū),參考 WOAH《陸生動物診斷試驗與疫苗手冊》第 3. 3. 12 雞傳染性法氏囊病,設(shè)計 VP2 高變區(qū)的一對通用引物,。Upper U3: 5’-GCATGCGGTATGTGAGGCTTGGTGAC-3’,Lower L3: 5’-GAATTCGATCCTGTTGCCACTCTTTC-3’雞傳染性法氏囊病病毒陽性對照分別為：超強毒株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(SD1205E5 株)，毒種編號為 CVCC AV358,，來源于國家獸醫(yī)微生物菌( 毒) 種保藏中心,；中等毒力及中等偏強毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(CF 株),毒種編號為 CVCC AV164，來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心,；雞傳染性法氏囊病病毒(NF8 株),，來源于乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠;弱毒力毒株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(B87 株)，毒種編號為 CVCC AV140,來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心,；變異株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(LN2023 株),，毒種編號為 CVCC AV1570,來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心。RNA 提取試劑盒,、RT-PCR 試劑,、DNA 片段回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶 EagI-HF 和 StuI,、瓊脂糖,、50xTAE、DNA marker,、無核酸酶水,、生理鹽水。取疫苗按瓶簽標示,用生理鹽水稀釋至每毫升至少含 10羽份,。陽性對照病毒含量至少應(yīng)為 100ELD50/0. 1ml,。將稀釋后的疫苗和陰、陽性對照按商品化核酸提取試劑盒進行 RNA 核酸提取,。將 3. 2 步驟提取的 RNA 進行反轉(zhuǎn)錄操作,。RT-PCR 反應(yīng)程序如下：第一階段，反轉(zhuǎn)錄,，用六聚體隨機引物作為反轉(zhuǎn)錄引物獲得cDNA,，在 0. 2ml PCR 管中加入:RNA 8μL，random hexamers(50μg/μL) 1μL,，10mM dNTP mix 1μL,，沸水浴 5min，冰浴 2min,；再加入10μL cDNA 合成預(yù)混液,，反應(yīng)體系見表 1。表 1 cDNA 合成預(yù)混液成分(10μL)
反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:25℃10min,；50℃50min,；85℃5min。第二階段,，95℃ 3min,；95℃ 40s,60℃ 30s，72℃ 40s,，30 個循環(huán)；72℃延伸 10min,。反應(yīng)體系見表 2:
3. 4PCR 產(chǎn)物回收,、酶切利用片段回收試劑盒對 PCR 產(chǎn)物進行回收,最終用 32μL 無核酸酶水進行洗脫。將回收產(chǎn)物利用 EagI-HF 和 StuI 進行酶切,，酶切體系(50μL)：10x Cutsmart Buffer 5μL,，DNA 30 μL，EagI-HF1μL,，StuI 1μL,，ddH2O 13μL，混勻后 37℃水浴 4h,。
3. 5 電泳
配 置 2% 瓊 脂 糖 凝 膠, 取 10μl 酶 切 產(chǎn) 物 進 行 電 泳,，130V,40min。
4. 結(jié)果判定
4. 1 試驗成立條件,陰性對照應(yīng)無條帶,不同毒力代表毒株應(yīng)出現(xiàn)相應(yīng)大小條帶,分別為:
超強毒株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(SD1205E5 株),、中等毒力及中等偏強毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(CF 株)應(yīng)出現(xiàn)大小約為 234bp,、233bp 和 89bp 條帶,實際檢測中僅可見234bp 左右的一個條帶，原因為 233bp 條帶和 234bp 條帶差異過小,會出現(xiàn)重疊,。89bp 條帶片段過小,，電泳不可見。
弱毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(B87 株)應(yīng)出現(xiàn)大小約為 556bp 條帶。
變異株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(LN2023 株)和中等毒力及中等偏強毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(NF8 株)應(yīng)出現(xiàn)大小約為 322bp 和 234bp 條帶,。
4. 2 檢測樣品如出現(xiàn)大小約為 556bp 的條帶,，則判定樣品中檢出 B87 株類似 IBDV 核酸；如出現(xiàn)大小約為 234bp 的條帶,，則判定樣品中檢出 CF 株類似或者 SD1205E5 株類似 IBDV 核酸,；如出現(xiàn)大小約為 322bp 和 234bp 的條帶，則判定樣品中檢出 LN2023 株類似株或者 NF8 株類似 IBDV 核酸,。
4. 3 如需明確具體的雞傳染性法氏囊病病毒種類,可將酶切片段回收后進行測序和 blast 比對,。
雞新城疫活疫苗中非法添加/ 改變制苗用毒種檢測方法
1. 1 本方法適用于雞新城疫活疫苗中非法添加/ 改變制苗用毒種的檢測。1. 2 非法添加/ 改變制苗用毒種的檢測范圍為基因Ⅶ型新城疫病毒核酸,。1. 3 檢測對象為雞新城疫活疫苗 La Sota 株,、Clone30 株、F 株,、HB1 株,、 N79 株、 CS2 株,、 V4/ HB92 株,、 ZM10 株、 VG/ GA 株 等 疫苗株,。針對雞新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)F 基因保守區(qū)域設(shè)計一對通用型引物,。NDV-F(Universas 型)-F:5’-ACAGGRTCAATCATAGT-3’NDV-F(Universas 型)-R:5’-CAGTAWGAGGTGTCAAG -3’針對基因Ⅶ型新城疫病毒 F 基因差異序列，設(shè)計一對基因Ⅶ型特異性引物,。NDV-F(Ⅶ型)-F:5’-AGTTTAATAATACGGCGCGA-3’NDV-F(Ⅶ型)-R:5’-GCAATAACTGAGCCYYTAAG -3’雞新城疫病毒 La Sota 株,，毒種編號為 CVCC AV1615，來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心,。基因Ⅶ型新城疫病毒核酸標準品,，編號為 CVCC Z333，來源于國家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心,。RNA 提 取 試 劑 盒、 RT - PCR 試 劑,、 瓊 脂 糖,、 50xTAE、 DNA取疫苗按瓶簽標示,用生理鹽水稀釋至每毫升至少含 100 羽份,；;陽性對照按瓶簽標示原倍或 10 倍稀釋后使用,。將稀釋后的疫苗和陰,、陽性對照按商品化核酸提取試劑盒進行 RNA 核酸提取。將 3. 2 步驟提取的 RNA 進行一步法 RT-PCR 反應(yīng),，一步法 RT-PCR 反應(yīng)程序如下:50°C 30min,92°C 2min,、94°C 30s、55°C 30s,、72°C 1min,共 30 個循環(huán),最后 72°C 延伸 10min,。一步法 RT-PCR反應(yīng)體系見表 1:表 1 一步法 RT-PCR 反應(yīng)體系(25μL)
3. 4 電泳
配置 1% 瓊 脂 糖 凝 膠, 取 10μl RT - PCR 產(chǎn) 物 進 行 電 泳，120V,，30min,。
4. 結(jié)果判定
4. 1 試驗成立條件,新城疫病毒(La Sota 株)通用型引物應(yīng)擴增出大小約為 842bp 條帶，基因Ⅶ型新城疫病毒特異性引物應(yīng)無條帶,；基因Ⅶ型新城疫病毒核酸標準品通用型引物應(yīng)擴增出大小約為 842bp 條帶,，基因Ⅶ型新城疫病毒特異性引物應(yīng)擴增出大小約為 609bp 特異性條帶；陰性對照均無條帶,，則試驗成立,。
4. 2 樣品用新城疫病毒通用型引物應(yīng)擴增出大小約為 842bp條帶。若用基因Ⅶ型新城疫病毒特異性引物擴增出大小約為609bp 條帶,，則判定樣品中檢出基因Ⅶ型新城疫病毒核酸,。
附件4：
禽用滅活疫苗中非法添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原檢測方法
1. 適用范圍
1. 1 本方法適用于禽用滅活疫苗中非法添加制苗用毒種的檢測。
1. 2 非法添加制苗用毒種的檢測范圍為禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原,。
2. 試驗材料
2. 1 實驗動物
SPF 雞,，4 ~6 周齡。
2. 2 試劑
禽腺病毒Ⅰ群瓊脂擴散試驗抗原,，陰性對照為 SPF 雞血清,，陽性對照為禽腺病毒Ⅰ群瓊脂擴散試驗陽性血清，均來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,；瓊脂粉或瓊脂糖,、氯化鈉,、PBS(0. 01M,、pH7. 2)。
3. 檢測方法
3. 1 免疫
用 4 ~6 周齡 SPF 雞 15 只,其中 10 只雞按制品推薦的免疫途徑和劑量進行免疫,。首次免疫后 14 天,，按照相同途徑(不同部位)和劑量進行第二次免疫。另取 5 只作為不免疫對照組,。第二次免疫后 21 日每只雞分別采血,，分離血清，用禽腺病毒 I 群瓊脂擴散試驗抗原進行抗體效價測定,。
3. 2 抗體效價測定
3. 2. 1 瓊脂板制備
稱取優(yōu)質(zhì)瓊脂粉或瓊脂糖 1g,、氯化鈉 8g,加入 PBS(0. 01M,、pH7. 2)溶液 100ml 中，置沸水中水浴加熱融化,，室溫冷卻至 60 ~65℃ 后,，倒入無菌平皿內(nèi)(瓊脂厚度約為 5mm)，冷凝后加蓋倒置平皿,，防止水分蒸發(fā),，隔日使用應(yīng)在 2 ~8℃保存。
3. 2. 2 打孔
用六角形打孔器在瓊脂上打孔,，孔徑 3 ~4mm,，孔間間距 3mm。
3. 2. 3 封底
挑出孔中瓊脂后,將平皿底部至酒精燈上微微加熱,，使孔底瓊脂稍微融化封底,。
3. 2. 4 加樣
中央孔滴加瓊擴抗原 50μl，第 2,、4 孔滴加陽性對照各 50μl,，第6 孔滴加陰性對照 50μl,第 1、3,、5 孔滴加待檢血清,，每孔 50μl。
3. 2. 5 反應(yīng)將瓊脂板放入濕盒中,，置 37℃溫箱內(nèi) 2 小時后倒置瓊脂板,，繼續(xù)作用至 24 小時，然后移至室溫再放置 48 ~ 72 小時,，觀察沉淀線,。
3. 2. 6 瓊脂擴散試驗(AGP)抗體檢測結(jié)果判定
3. 2. 6. 1 試驗成立條件，抗原孔與陽性對照之間出現(xiàn)沉淀線,，與陰性對照之間無沉淀線出現(xiàn),，抗體檢測試驗成立。
3. 2. 6. 2 當待檢血清與抗原孔之間形成沉淀線,，并與陽性對照的沉淀線末端吻合,，則待檢血清判為陽性；當待檢血清與抗原孔之間未形成沉淀線,，但陽性對照的沉淀線末端向待檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎,則判為弱陽性,。弱陽性樣品應(yīng)重檢一次，仍為弱陽性時可判為陽性,；當待檢血清與抗原孔之間未形成沉淀線,，或陽性對照與抗原孔間的沉淀線末端向毗鄰的待檢血清孔直伸或向外側(cè)偏彎時，則判該待檢血清為陰性,。
4. 結(jié)果判定
4. 1 試驗成立條件,對照組雞 AGP 抗體應(yīng)全部為陰性,試驗成立,。
4. 2 若待檢樣品免疫雞血清 1 份及以上出現(xiàn) AGP 抗體陽性,，則判定該疫苗中添加了禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原；若待檢樣品免疫雞血清均未出現(xiàn) AGP 抗體陽性,，則判定該疫苗中未添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原,。
來源：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部。
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